L'île n'a pas de vestiges des premiers occupants, les Liguriens, qui seront bientôt suivis par les Romains qui s'y sont installés un oppidum. À partir du Ve siècle et depuis mille ans, Sainte-Marguerite appartient aux moines de Lérins. Une chapelle construite en l'honneur de Sainte-Marguerite portera son nom.
La position stratégique de l'île n'échappe pas au duc de Guise qui ordonna en 1617 la construction d'un ouvrage défensif destiné à verrouiller l'accès à Cannes. Le modeste bâtiment a été agrandi par les Espagnols qui ont occupé l'île pendant la guerre de 30 ans.
Les Français ont ensuite repris possession de la ville et Vauban s'est rendu sur l'île et a donné des instructions sur la manière de la renforcer. Le Fort Royal a peu changé depuis que ces travaux ont été réalisés à la fin du 17ème siècle.
Elle est devenue une prison d'État en 1685. L'histoire a retenu quelques prisonniers célèbres, dont le général Bazaine, le seul à s'être échappé du fort, et le mystérieux Homme au masque de fer. Certaines cellules peuvent encore être visitées aujourd'hui.
