La grandeur des monarques catholiques d'Espagne se voit mieux à la Capilla Real (chapelle royale), qui abrite les tombes royales. Cette impressionnante chapelle en forme de dôme de 47 mètres de haut est attachée à la cathédrale Santa María de la Encarnación mais possède une entrée séparée; c'était un ajout à la cathédrale construite de 1506 à 1521 en style gothique tardif.
L'intérieur présente de beaux vitraux du XVIe siècle et sept grandes peintures d'Alonso Cano. Une calandre ouvragée par Bartolomé de Jaén entoure les tombes royales richement décorées. À droite, le tombeau de Ferdinand et d'Isabelle dans un monument en marbre de Carrare créé par le sculpteur Domenico Fancelli de Florence.
La crypte abrite des sarcophages d'autres rois et princes. À gauche, la tombe de Philippe le Beau et de Jeanne la Folle de Bartolomé Ordóñez. Un grand retablo magnifiquement sculpté derrière les tombes royales présente des statues des Rois Catholiques de Diego de Siloé. Dans les transepts se trouvent des relicarios richement décorés (autels latéraux) d'Alonso de Mena. Le transept nord présente le célèbre triptyque de la passion de Dieric Bouts.
Un point culminant de la Capilla Real est la sacristie, un trésor d'œuvres d'art, y compris la peinture du Christ sur le mont des Oliviers de Botticelli, la Pietà de Rogier van der Weyden et la descente de croix de Hans Memling. La collection présente également des figures en bois polychrome des monarques catholiques en prière par Felipe Vigarny; L'épée du roi Ferdinand; Couronne de la reine Isabelle; et un livre de prières, qui appartenait aux Rois Catholiques
